O calor é necessário para a coloração de esporos porque a aplicação de calor interrompe as células vegetativas e faz com que a malaquita verde seja enxaguada delas, o que permite que a contracoloração entre nas células. Esta é uma etapa necessária em certos esporos que são resistentes aos métodos tradicionais de coloração de esporos.
De acordo com o Austin Community College, a coloração é uma técnica usada por cientistas para identificar os esporos em uma amostra de bactéria. Uma das etapas mais importantes na coloração de esporos é antecipar as propriedades do esporo que está sendo analisado, porque alguns deles são resistentes aos processos tradicionais de morte. Freqüentemente, isso é resultado de sua dura camada externa de proteína, conhecida como queratina. Para endosporos desta natureza, é necessário utilizar uma técnica de coloração por calor para manchar os esporos com sua coloração primária, verde malaquita.
A aplicação de calor enfraquece a parede de uma célula e permite que ela seja enxaguada e permeada por corantes. A célula original que forma um endosporo é chamada de célula vegetativa. Essas células são mais suscetíveis ao calor do que os próprios endosporos e podem ser enxaguadas e tingidas com verde malaquita. Com base no inchaço e nas reações dos endosporos, esse processo de tingimento pode ser usado para identificar esporos que possuem camadas resistentes e protetoras.
