As reações de fotossíntese independentes da luz, conhecidas como reações escuras, usam ATP e NADPH gerados durante as reações de luz para sintetizar precursores de açúcar. No cenário mais comum, chamado de Ciclo de Calvin, o dióxido de carbono é incorporado em um composto estável de três carbonos denominado fosfoglicerato (PGAL), que serve como precursor da glicose e de outros açúcares. Seis voltas do Ciclo de Calvin geram o equivalente a uma molécula de glicose.
Os biólogos dividem as plantas em três categorias chamadas C3, C4 e CAM, com base no mecanismo e na localização das reações escuras da fotossíntese. A maioria das plantas são designadas C3, o que significa que o primeiro composto estável que geram nas reações no escuro é PGAL. Este caminho é ideal para plantas que vivem em ambientes amenos com umidade abundante e dióxido de carbono. Exemplos de plantas C3 incluem trigo, arroz, aveia e tomate.
Em contraste, as plantas C4 tendem a habitar ambientes mais quentes e secos. Exemplos incluem milho, cana-de-açúcar e sorgo. Para minimizar a perda de água, as plantas C4 possuem uma estrutura especializada chamada anatomia Kranz, na qual a fotossíntese ocorre em células dispostas como uma coroa ou camada de bainha de feixe. Plantas C4 combinam dióxido de carbono com fosfoenolpiruvato para formar OAA (oxaloacetato). O OAA é convertido em malato, que se difunde nas células da bainha do feixe e libera dióxido de carbono, que imediatamente entra no Ciclo de Calvin. Ao concentrar o dióxido de carbono na camada celular mais interna da planta, menos água é perdida devido à transpiração.
Finalmente, certas plantas do deserto, como cactos e agave, desenvolveram uma forma de fotossíntese chamada CAM, que significa Metabolismo do Ácido Crassuláceo. Essas plantas devem conservar a água de forma ainda mais eficiente do que as plantas C4. Em vez de manter seus estômatos (células de poro) abertos durante o dia como as plantas C3 e C4, as plantas CAM os mantêm abertos à noite para acumular dióxido de carbono, que armazenam como malato ou aspartato em um vacúolo intracelular. Durante o dia, a planta aproveita essas reservas de dióxido de carbono, canalizando CO2 para o Ciclo de Calvin sem perder água para o meio ambiente. Isso explica por que os cloroplastos dos cactos são encontrados no corpo da planta, e não nas folhas. O ciclo CAM também é responsável pela capacidade das xerófitas (plantas do deserto) de sobreviver por meses ou anos sem chuva.