A especiação, comumente conhecida como macroevolução, é apoiada por várias linhas de evidência, incluindo observação direta, mapeamento genético e registro fóssil. Várias populações foram observadas no ato de se dividir em novas espécies. A comparação de sequências genômicas entre espécies é mais facilmente explicada como resultado de ancestralidade comum recente e um extenso registro fóssil rendeu vários fósseis de transição.
A macroevolução foi observada diretamente em um tipo de planta com flores chamada barba-de-cabra americana. Introduzido nas Américas, vindo da Europa no início do século 20, três espécies de barba-cabra começaram a se hibridizar na natureza. Na década de 1950, eles produziram duas novas variedades que podiam se reproduzir dentro de suas próprias populações, mas não com as barbas de cabra vizinhas, que é o critério para ser rotulado como uma nova espécie.
A comparação genética direta entre humanos e chimpanzés fornece mais evidências de especiação. Os humanos têm 46 cromossomos, enquanto os chimpanzés e gorilas têm 48. O cromossomo 2 humano, no entanto, tem sequências distintas de nucleotídeos que sugerem que é o resultado da fusão entre dois cromossomos em algum ponto no passado relativamente recente. A explicação mais plausível para esse fato é que humanos e chimpanzés são intimamente relacionados, mas divergem em espécies diferentes.
O registro fóssil é rico em fósseis de transição, demonstrando o desenvolvimento de novas espécies e grupos maiores. Em particular, as transições de répteis para mamíferos, répteis para pássaros e macacos para humanos são bem evidenciadas por fósseis.
