Algumas cidades importantes no mapa do rio Ohio são Pittsburgh, Pensilvânia; Cincinnati, Ohio; Louisville, Kentucky; Huntington, West Virginia; e Evansville, Indiana. Outros locais notáveis ao longo do rio Ohio são as cidades de Parkersburg, Wheeling e Weirton, na Virgínia Ocidental, bem como a cidade de Owensboro em Kentucky.
O rio Ohio começa em Pittsburgh. De lá, o rio flui para o norte pelas cidades da Pensilvânia de Sewickley, Coraopolis, Ambridge e Aliquippa. Na cidade de Rochester, o rio Ohio vira para oeste. O rio então passa pelas cidades de Beaver e Midland antes de chegar à fronteira da Pensilvânia com o estado de Ohio.
Ao passar pela cidade de East Liverpool em Ohio, o rio vira para o sul. A rota do rio define a fronteira de Ohio com a Virgínia Ocidental. As cidades do lado do rio em Ohio incluem Steubenville, Martins Ferry, Marietta e Gallipolis. As cidades do lado do rio na Virgínia Ocidental incluem Wheeling, New Martinsville, Parkersburg, Point Pleasant e Huntington.
Em torno da cidade de Ironton, em Ohio, o rio Ohio começa a definir a fronteira entre os estados de Ohio e Kentucky. Algumas cidades do Kentucky na fronteira com Ohio incluem Ashland, Vanceburg, Maysville, Brooksville e Newport. Depois que o rio passa por Cincinnati, o rio começa a definir a fronteira de Kentucky com Indiana. Depois de passar pela cidade de Mount Wilson em Indiana, o rio Ohio define a fronteira de Kentucky com Illinois. O rio Ohio deságua no rio Mississippi em Cairo, Illinois.
